Estudio traducido al español sobre la leche de cucaracha (versión en inglés)

Estructura de un heterogéneo, glicosilada, unidos a lípidos, en el cristal de proteína in vivo-crecido a resolución atómica de la cucaracha punctata diploptera vivíparos

Sanchari Banerjee, un ‡ Nathan P. Coussens, b, c ‡ François-Xavier Gallat, d Nitish Sathyanarayanan, un Srikanth Jandhyam, e Koichiro J. Yagi, f James Gray SS, b, g Stephen S. Tobe, f Barbara Stay, h Leonard MG Chavasd, i * y Subramanian Ramaswamya, B, e *
aInstitute de Biología de Células Madre y Medicina Regenerativa, Bellary Road, Campus GKVK, Bangalore, Karnataka 560 065, India, b Departamento de Bioquímica, Carver Facultad de Medicina de la Universidad de Iowa, Iowa City, IA 52242, EE.UU., Centro cNational para el Avance de Ciencias de transferencia , Institutos nacionales de la Salud, 9800 Medical Center Drive, Rockville, MD 20850, EE.UU., Centro de Investigación dStructural Biología, Organización de Investigación del Acelerador de alta Energía, Tsukuba, Ibaraki 305 a 0801, Japón, Centro Electrónico para plataformas celular y Molecular, Bellary Road, Campus GKVK , Bangalore, Karnataka 560 065, India, FDepartment de Biología celular y de Sistemas, Universidad de Toronto, Toronto, ON M5S 3G5, Canadá, GBIO-Research Products Inc., Cherry Street, North Liberty, IA 52317, EE.UU., hDepartment de Biología, Universidad de Iowa, Iowa City, IA 52242, EE.UU., y la División de iExperimental, Sincrotrón Soleil, BP 48, l’Orme des Merisiers, 91192 Gif-sur-Yvette, Francia
* Correspondencia e-mail: [email protected], [email protected]

 
Editado por J. L. Smith, de la Universidad de Michigan, EE.UU. (Recibido el 25 de abril de 2016. Aceptado el 2 de de junio de de 2016; en Internet el 27 de junio de 2016)
cristales macromoleculares para los estudios de difracción de rayos X típicamente se cultivan in vitro de muestras puras y homogéneas; Sin embargo, hay ejemplos de cristales de proteínas que se han identificado in vivo. Los acontecimientos recientes en técnicas de micro-cristalografía y el advenimiento de láseres de rayos X de electrones libres han permitido la determinación de varias estructuras de las proteínas de los cristales crecidos en cellulo. Aquí, la estructura cristalina de una resolución atómica (1,2 Å) se informó de proteínas de la leche heterogéneas cultivadas dentro de un organismo vivo en su nicho funcional. Estos cristales crecidos-vivo en fueron aislados del intestino medio de un embrión dentro de la cucaracha vivíparos único conocido, punctata diploptera. Las proteínas de la leche cristalizado en el grupo espacial P1, y una estructura se determinó mediante dispersión anómala de los átomos de S nativos. Los datos revelaron proteínas glicosiladas que adoptan una lipocalina veces, se unen los lípidos y se organizan para formar una red cristalina muy llena. se estima un solo cristal para contener más de tres veces la energía de una masa equivalente de la leche de vaca. Esta forma de almacenamiento única de alimento para los embriones en desarrollo permite el acceso a un suministro constante de nutrientes completas. En particular, las proteínas de la leche cucaracha cristalinas son muy heterogéneos con respecto a la secuencia de aminoácidos, glicosilación y la composición de ácidos grasos unida. Estos datos representan un ejemplo único de la heterogeneidad de proteínas dentro de un solo cristal en vivo-crecido de una proteína natural en su entorno nativo con una resolución atómica.

Palabras clave: azufre SAD; glicosilación; viviparidad en cucaracha; la heterogeneidad de la proteína.

referencias PDB: Lili-MIP, estructura de alta resolución, 4nyq; S-SAD estructura, 4nyr; estructura recristalizada, 5epq

1. Introducción

Viviparidad, la alimentación materna de los embriones durante el desarrollo, es un tipo muy evolucionado de la reproducción que se produce en muchos grupos de animales. Las cucarachas han evolucionado en los últimos 320 millones de años (Garwood y Sutton, 2010 [Garwood, R. & Sutton, M. (2010) Biol Lett 6, 699-702…..]; Garwood et al, 2012 [Garwood, R., Ross, A., sotty, D., Chabard, D., Charbonnier, S., Sutton, M. & Withers, PJ (2012). PLoS One, 7, e45779.]). Una característica interesante de su evolución se encuentra en su modo de reproducción. Hay tres tipos generales de cucarachas: ([.. Roth, L. M. (1970) Annu Rev. Entomol 15, 75-96..] Roth, 1970) ovíparos, ovovivíparos y vivíparos. Las especies ovíparas (por ejemplo, Periplaneta americana) o bien depositar la ooteca (adjuntando los huevos fertilizados) sobre un sustrato o retenerlos, extruido y unido al cuerpo de la hembra (Roth y Willis, 1954 [Roth, LM y Willis, ER (1954). Smiths. Misc. Collect. 122, 1-49.]). Las especies ovovivíparas (por ejemplo Rhyparobia maderae) depositar la ooteca en el saco de cría de la hembra. En este saco de cría o el útero, los embriones son la protección y suministro de agua, pero no con nutrientes (Nalepa & Bell, 1997 [Nalepa, CA & Bell, WJ (1997). La evolución del comportamiento social en insectos y arácnidos. Universidad de Cambridge Prensa.]). punctata diploptera es la cucaracha vivíparos sólo se conoce, una condición evolutivamente avanzado en el que los huevos tienen poco vitelo, pero las crías en desarrollo son alimentados directamente por la madre de la pared de cría salida. Viviparidad mejora el desarrollo de las larvas, ya que el tiempo hasta la madurez reproductiva se reduce sustancialmente en D. punctata en relación con las especies ovovivíparas (Roth y Willis, 1954 [Roth, LM y Willis, ER (1954). Smiths. Misc. Collect. 122, 1- 49.];. Willis et al, 1958 [Willis, ER, vertical, GR & Roth, LM (1958) Ann Entomol Soc Am 51, 53-69];…… alojarse y Coop, 1973 [EN CASA, B. & Coop, A. (1973) J. Physiol insectos 19, 147-171], 1974 [Stay, B. & Coop, CA (1974) Cell Tissue, 6, 669-693];….. Roth , 1989 [Roth, LM (1989). Proc. Entomol. Soc. Wash. 91, 441-451.]). Utilizando la yema escasa, los embriones se desarrollan rápidamente D. punctata fuertes músculos faríngeos y un intestino sencilla, lo que les permite absorber y depositar en sus intestinos medios una leche líquida rica en proteínas secretadas por el saco de cría (Stay & Coop de 1973 [EN CASA, B. y Coop, A. (1973) J. Physiol insectos 19, 147-171], 1974 [EN CASA, B. & Coop, CA (1974) Cell Tissue, 6, 669-693];….. Evans & Stay , 1989 [Evans, LD & Stay, B. (1989). Invertebr. Reprod. Dev. 15, 171-176.]). Esta leche proporciona un aumento de todo el cuerpo 60 veces en la proteína durante el desarrollo embrionario (Stay & Coop, 1973 [EN CASA, B. & Coop, A. (1973). J. Physiol de insectos. 19, 147-171.]). Los análisis de ADN complementario reveló 22 péptidos distintos, pero similares codificadas por genes de la leche con homología a la familia de la lipocalina de proteínas de unión a lípidos (Williford et al., 2004 [Williford, A., estancia, B. & Bhattacharya, D. (2004). Evol. Dev. 6, 67-77.]), que se conoce como lipocalina-como las proteínas de la leche o Lili-MIP en este artículo. Poco después de la ingestión de la leche líquida, cristales de proteínas se desarrollan en el intestino medio del embrión (Ingram et al., 1977 [Ingram, MJ, Stay, B. & Caín, GD (1977). Insecto Biochem. 7, 257-267.]) . Se muestran los cristales que contienen glicoproteínas de la leche, aunque menos glicosilada que en el momento de la secreción del saco de cría (Ingram et al., 1977 [Ingram, MJ, estancia, B. & Cain, GD (1977). Insect Biochem. 7 , 257-267];.. Williford et al, 2004 [Williford, A., Stay, B. & Bhattacharya, D. (2004) Evol Dev 6, 67-77])….. Por lo tanto, en viviparidad D. punctata implica la evolución de un saco de cría secretoras de leche y el rápido desarrollo de los embriones que son capaces de beber y, sobre todo, almacenar nutrientes completos (proteínas, carbohidratos y lípidos) se concentraron en forma cristalina. Las propiedades de estos en cristales de proteínas de la leche in vivo de cosecha están asociados con la evolución de viviparidad en cucarachas y son objeto del presente estudio.

En los cristales de proteínas in vivo-crecido se han identificado a partir de un grupo diverso de organismos (Doye y Poon, 2006 [Doye, JPK y Poon, WCK (2006) Curr Opin coloide Interface Sci 11, 40-46…..]; Lange et al., 1982 [Lange, RH, Grodzinski, Z. y Kilarski, W. (1982) Cell Tissue Res 222, 159-165…]; Dogan et al, 2012 [Dogan, S., Barnes, L. . & Cruz-Vetrano, WP (2012) de cabeza y cuello Pathol 6, 111-120];…. Pande et al, 2001 [Pande, A., Pande, J., Asherie, N., Lomakin, A., Ogun, O., rey, J. & Benedek, GB (2001). Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 98, desde 6116 hasta 6120.]). Su presencia dentro de las células se ha relacionado con funciones biológicas tales como la secreción de insulina (Dodson y Steiner, 1998 [Dodson, G. & Steiner, D. (1998). Curr. Opin. Struct. Biol. 8, 189-194.]) , la clasificación de las proteínas de secreción en el aparato de Golgi (Arvan & Castle, 1998 [Arvan, P. & Castle, D. (1998). Biochem. J. 332, 593-610.]), la patogenicidad en Bacillus thuringiensis (van Frankenhuyzen, 2013 [Frankenhuyzen, K. van (2013). J. Invertebr. Pathol. 114, 76-85.]), los mecanismos de almacenamiento de virus infecciosos (Coulibaly y col., 2005 [Coulibaly, F., Chevalier, C., Gutsche , I., Pous, J., Navaza, J., Bressanelli, S., Delmas, B. & Rey, FA (2005). Cell, 120, 761-772.], 2007 [Coulibaly, F., Chiu, E., Ikeda, K., Gutmann, S., Haebel, PW, Schulze-Briese, C., Mori, H. & Metcalf, P. (2007). Nature (London), 446, 97-101.], 2009 [Coulibaly, F., Chiu, E., Gutmann, S., Rajendran, C., Haebel, PW, Ikeda, K., Mori, H., Ward, VK, Schulze-Briese, C. & Metcalf, P . (2009). Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 106, 22205 a 22.210.]) y de las proteínas del desarrollo en semillas (Doye y Poon, 2006 [Doye, JPK y Poon, WCK (2006). Curr. Opin. Interfaz coloide Sci. . 11, 40-46]) y los huevos (. Papassideri et al, 2007 [Papassideri, IS, Trougakos, IP, Leonard, KR y Margaritis, LH (2007) J. Physiol insectos 53, 370-376]…; . Snigirevskaya et al, 1997 [Snigirevskaya, ES, Hays, AR & Raikhel, AS (1997) Cell Tissue Res 290, 129-142….]; Lange et al, 1982 [Lange, RH, Grodzinski, Z. y Kilarski, W. (1982). Cell Tissue Res. 222, 159-165.]). En los seres humanos, los cristales presentes en la naturaleza se han asociado con estados de enfermedad incluyendo la histiocitosis (Dogan et al., 2012 [Dogan, S., Barnes, L. & Cruz-Vetrano, WP (2012). Head Neck Pathol. 6, 111-120 .]), la hemoglobina C (Doye y Poon, 2006 [Doye, JPK y Poon, WCK (2006). Curr. Opin. coloide Interface Sci. 11, 40-46.]) y cataratas (Pande et al., 2001 [ Pande, A., Pande, J., Asherie, N., Lomakin, A., Ogun, O., rey, J. & Benedek, GB (2001). Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 98, 6116- 6120.]). En estas condiciones de crecimiento del cristal puede ser una coincidencia, pero se asocia con la patología. En este informe, nuestro análisis de los cristales de Lili-MIP muestra que contienen una mezcla heterogénea de secuencias de aminoácidos en vivo y difractan a resolución atómica.

cristales macromoleculares para los estudios de difracción de rayos X típicamente se cultivan a partir de muestras puras y homogéneas. La heterogeneidad de las modificaciones después de la traducción se considera para reducir significativamente la probabilidad de obtener cristales bien de difracción. En el caso de la glicosilación, que es heterogéneo por naturaleza, se hacen grandes esfuerzos para deglycosylate proteínas de interés para favorecer moléculas químicamente homogéneas y estructuralmente monodispersas antes de la cristalización. De manera anecdótica, químicos y bioquímicos tempranos utilizaron la cristalización para aislar las especies de un solo molecular.

 
El número de estructuras cristalinas de rayos X que se han determinado a partir de cristales en vivo de cosecha es baja. El principal reto en su determinación de la estructura se encuentra en la manipulación de tales cristales a fuentes de rayos X de tercera generación debido a sus pequeñas dimensiones físicas (Koopmann et al., 2012 [Koopmann, R. et al. (2012). NAT. Métodos , 9, 259-262.]). Las estructuras cristalinas de los poliedros de baculovirus se han determinado hasta 2,2 Å de resolución de microcristales cultivadas in vivo (Coulibaly y col., 2009 [Coulibaly, F., Chiu, E., Gutmann, S., Rajendran, C., Haebel, PW, Ikeda, K., Mori, H., Ward, VK, Schulze-Briese, C. & Metcalf, P. (2009). Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 106, 22205 a 22.210.]). sistemas de expresión de baculovirus se han utilizado para inducir la cristalización intracelular de la catepsina B de Trypanosoma brucei (tbcatb) y el virus de la polihedrosis citoplásmica (CPV) poliedros de Bombyx mori, permitiendo de ese modo la determinación de estructuras de tbcatb a 2,1 Å de resolución (Redecke et al., 2013 [Redecke , L. et al (2013) Science, 339, 227-230];…. Koopmann et al, 2012 [Koopmann, R. et al (2012) Nat Métodos, 9, 259-262])…. y de CPV a 2,0 Å de resolución (Coulibaly y col., 2007 [Coulibaly, F., Chiu, E., Ikeda, K., Gutmann, S., Haebel, PW, Schulze-Briese, C., Mori, H. y Metcalf, P. (2007). Nature (London), 446, 97-101.]). En los cristales in vivo-crecido recientemente han sido también interrogado por cristalografía de femtosegundo serie (SFX) a las fuentes de rayos X láser de electrones libres (XFEL) como una solución potencial para resolver estructuras de los sistemas que no son susceptibles a la cristalografía convencional, tales como complejos macromoleculares y químicamente las proteínas no tratados (Gallat et al., 2014 [Gallat, F.-X. et al. (2014). Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci. 369, 20130497.]). La estructura de la toxina del Bacillus thuringiensis Cry3A de en los cristales in vivo-crecido se ha determinado directamente de las células bacterianas utilizando SFX (Sawaya et al., 2014 [Sawaya, MR et al. (2014). Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 111, 12.769-12.774.]). Con la excepción de CPV, ninguna de estas proteínas cristalizó dentro de su nicho funcional.

Todos los cristales descritos anteriormente que se podría llamar en cristales CELLULO. En comparación con en los cristales CELLULO-crecido, relativamente grandes cristales de proteína (hasta 10 x 10 x 30 micras) fueron identificados en el intestino medio (in vivo) de los embriones en desarrollo de la cucaracha D. punctata (Fig 1 [link];. Ingram et al., 1977 [Ingram, MJ, Stay, B. & Caín, GD (1977). Insect Biochem. 7, 257-267.]). Mientras que los volúmenes citoplasmáticos de células imponen limitaciones de tamaño de los cristales de proteínas cultivadas en cellulo, el volumen sustancialmente mayor del intestino medio cucaracha permite que los cristales más grandes se desarrollen. Sorprendentemente, estos cristales de proteínas producían difracción a una resolución de 1,2 Å y nos informan de la primera estructura de una forma natural y químicamente inalterado, cristal de proteína heterogénea crecido in vivo a resolución atómica.

proteina leche de cucaracha
En vivo-crecido cristales Lili-MIP de D. punctata. microscopía polarizada revela cristales de proteínas birrefringentes cerrados en el interior del intestino medio del embrión y una vista ampliada de los cristales extraídos (recuadro).

2. Materiales y métodos

2.1. el aislamiento de cristal de las condiciones in vivo

Los cristales se extraen de los intestinos medios de embrión de D. punctata. Las cucarachas, las cuales fueron alimentadas Lab Chow (Purina, St Louis, Missouri, EE.UU.) y agua, se mantuvieron a una temperatura ambiente de 27 ° C, con una luz y oscuridad ciclo de 12 horas cada uno. 12 huevos fecundados se depositan en el saco camada de 7-8 días de edad, las hembras apareadas. Para obtener cristales, los embriones se extruyeron suavemente del saco de cría de una hembra de 54 días de edad. El intestino medio se aisló de cada embrión por el corte de la cabeza y el extremo del abdomen, permitiendo que el intestino medio a extruir en una solución de Ringer de insectos. Complementario de la película S1 muestra cómo un corte hecho en el intestino medio permite su contenido a ser extruidas por la contracción de los músculos de la pared del intestino medio. Los cristales se recogieron en una pipeta Pasteur y se transfieren a agua dulce estéril, en el que son insolubles. Antes de los experimentos de difracción de rayos X, los cristales se cryoprotected en 20% de glicerol y el flash se enfriaron en N2 líquido.

2.2. Procedimiento de recogida de datos cristalográfica de cristales de alta resolución

Datos a 1,20 Å de resolución se midieron usando un detector CCD MAR en PXII línea de luz en el Swiss Light Source (SLS), Villigen, Suiza en una longitud de onda de 0,8349 Å (Pohl et al., 2006 [Pohl, E., Pradervand, C. , Schneider, R., Tomizaki, T., Pauluhn, A., Chen, P., Ingold, G., Zimoch, E. y Schulze-Briese, C. (2006). Sincrotrón Radiat. Noticias. 19, 24- 26.]). La distancia de muestra a detector se fijó a 100 mm. Todas las colecciones de datos se realizaron a temperaturas muy bajas temperaturas utilizando una corriente de 70 K de nitrógeno. los conjuntos de datos individuales se reducen con el software d * TREK (Pflugrath, 1999 [Pflugrath, J. W. (1999). Acta Cryst. D55, 1718-1725.]).

2.3. La recristalización y recopilación de datos de la proteína solubilizada

cristales Lili-MIP obtenidos in vivo se solubilizaron en 50 mM de acetato de sodio pH 5,0. cromatografía de exclusión por tamaño se llevó a cabo en la proteína solubilizada utilizando una columna Superdex 200 prep grado. La proteína eluye como una fracción homogénea y monodispersas en 95,5 ml y se utilizó para la cristalización. Sobre la base de la filtración en gel estándar Bio-Rad (Bio-Rad catálogo No. 151 a 1901), la proteína Lili-Mip se calculó para eluir como un monómero con un peso molecular de aproximadamente 24 kDa. Purificada Lili-Mip se cristalizó en 25% de PEG 10 000 a una concentración de 2 mg ml-1 y una temperatura de 293 K. La alta concentración de PEG en la condición de cristalización sirve como el PEG crioprotector y por lo tanto adicional o no se añadieron glicerol. Los tamaños de la recristalizada y los cristales crecer in vivo fueron similares. El tamaño del cristal utilizado para la recogida de datos fue de 15 × 20 micras. Los datos de difracción de rayos X para estos cristales se recogieron en la línea de luz PROXIMA-1 en el sincrotrón SOLEIL, Francia, en una longitud de onda de 0,97857 Å. La distancia de muestra a detector se fijó a 270,6 mm. Todas las colecciones de datos se realizaron a cryotemperature usando una corriente de nitrógeno a 100 K.

2.4. Determinación de la estructura de S-SAD

Ab initio determinación de la estructura se realizó por medición de la señal de dispersión anómala de átomos de S a una longitud de onda de 2,7 Å (4,6 keV). Los datos de los siete cristales se fusionaron para mejorar aún más la señal anómala. Reflexiones fueron recogidos con un detector de Dectris PILATUS 2M-F en BL-1A en la fábrica de fotones (PF), Tsukuba, Japón. La distancia de muestra a detector se fijó a 60 mm. 720 ° de los datos se obtuvieron de cada cristal, con un tiempo de exposición de 0,2 s por imagen y un ángulo de oscilación de 0,2 °. La subestructura de azufre se determinó utilizando el SHELXC, SHELXD y tubería SHELXE (Sheldrick, 1990 [Sheldrick, G. M. (1990). Acta. Cryst A46, 467-473.]). Tres sitios de dispersores anómalos, que corresponden a dos puentes disulfuro y un átomo de S Met, se obtuvieron inicialmente. La mano correcta fue seleccionado usando el mapa coeficiente de correlación como el indicador. La densidad inicial calculado de la mano correcta se refinó aún más con modificaciones de histograma de disolvente utilizando SHELXE y Phaser (McCoy et al., 2007 [McCoy, AJ, Grosse-Kunstleve, RW, Adams, PD, Winn, MD, Storoni, LC & Read , RJ (2007). J. Appl. Cryst. 40, 658-674.]) de la suite CCP4 (Winn et al., 2011 [Winn, MD et al. (2011). Acta Cryst. D67, 235-242 .]). El modelo se construye a partir de esta densidad a través de varios ciclos de estructura secundaria cesión de montaje y de la cadena lateral dentro AUTOSOL de la suite PHENIX (Adams et al., 2010 [Adams, PD et al. (2010). Acta Cryst. D66, 213 -221.]).

2.5. refinamiento de la estructura

Las tres estructuras de Lili-MIP en 1,2, 1,75 y 2,5 Å de resolución fueron refinados a través de ciclos iterativos de refinamiento restringido el uso de la suite PHENIX (Adams et al., 2010 [Adams, PD et al. (2010). Acta Cryst. D66, 213-221.]) junto con la construcción de modelo manual de la densidad de electrones generados con Coot (Emsley y Cowtan, 2004 [Emsley, P. & Cowtan, K. (2004). Acta Cryst. D60, 2126-2132.]) hasta la convergencia (Tabla 1 [link]). coordenadas atómicas y factores de estructura para las estructuras cristalinas reportados han sido depositadas en el Protein Data Bank con los códigos de adhesión 4nyr (Lili-MIP de S-SAD fases), 4nyq (Lili-MIP en el 1,2 Å de resolución) y 5epq (in vitro cristalizado Lili-MIP). Los mapas de diferencias que muestran las densidades electrónicas para los residuos heterogéneos se prepararon utilizando v.2.10.2 BUSTER (Smart et al., 2012 [inteligente, sistema operativo, Womack, A, Flensburg, C, Keller, P., Paciorek, W. , Sharff, A., Vonrhein, C. & Bricogne, G. (2012). Acta Cryst. D68, 368-380.]). conformaciones alternadas de estos residuos heterogéneos fueron modelados con múltiples ocupaciones utilizando la focha. Montaje de los sitios con los residuos heterogéneos de ambas secuencias Lili-MIP refinado por completo la estructura sin la densidad adicional.
estadísticas de recolección de datos y el refinamiento de rayos X

propiedades leche cucaracha

2.6. Espectrometría de masas

Todas las muestras de proteína se disolvieron en 50% de ácido trifluoroacético en acetonitrilo / 0,3% para análisis de masas MALDI-TOF. Masa análisis de la proteína nativa se llevaron a cabo con un láser de desorción / ionización asistida por matriz espectrómetro Voyager-DE STR tiempo-de-vuelo de masas (Perspective Biosystems, Framingham, Massachusetts, EE.UU.). Se utilizó el método policristalino-capa descrito por Beavis y Chait (1996 [Beavis, RC y Chait, BT (1996). Methods Enzymol. 270, 519-551.]) para aplicar la muestra sobre una diana de chapado en oro con α- ciano-4-hidroxicinámico como matriz. muestras nativas y digeridas con RNasa B sirvieron como patrones de calibración externos para la proteína de la leche cristalina. La proteína se desglicosila usando 10 unidades de 1 unidad de l-1 N-glicosidasa F (Roche) en tampón de bicarbonato de amonio 50 mM pH 7,5 a 37 ° C durante 20 h.

muestras glucosilada Lili-MIP se digirieron con tripsina o Asp-N y la muestra desglicosilada con Asp-N solo utilizando una relación enzima: sustrato de 1:30. Las muestras que contienen 0,5 mg de los péptidos digeridos se cargaron en un Zorbax 300SB-C18, 5 m, 5 × 0,3 mm de columna usando disolvente A (100% de acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1%) a una velocidad de flujo de 30 l min-1 para 5 min. Después de la captura y la desalación, los péptidos fueron transferidos a una columna analítica (Eksigent HALO C18 2,7 um, 90 Å, 100 × 0,5 mm) con un caudal de 15 l por min y se resolvieron con un 40 min LC-MS duración de Asp- N digerido péptidos desglucosilados ya 30 min LC-MS ejecuta para péptidos glicosilados digeridas con tripsina o Asp-N. LC se realizó utilizando un Eksigent nanoLC 425 y MS se realizó con un AB Sciex TripleTOF 5600+. Los datos brutos fueron adquiridos utilizando el software v.1.6 analista. El análisis de MS se realizó en el modo AIF con diez MSMS experimentos. El procesamiento de datos se realizó con el software ProteinPilot. Los péptidos obtenidos después de la escisión de la proteína desglicosilada con Asp-N mostraron% de cobertura 100 de secuencia para Lili-Mip 1 y Lili-Mip 2, y 53,5% para la secuencia Lili-Mip 3. Los péptidos obtenidos tras la escisión con tripsina de la proteína glicosilada mostraron el 71,6, el 47,4 y el 25,2% la cobertura de secuencia para Lili-MIP 1, Lili-MIP-2 y Lili Mip 3, respectivamente. Los péptidos obtenidos después de la escisión de la proteína glicosilada con Asp-N mostraron el 40,7 y el 34,2% la cobertura de secuencia para Lili-MIP-1 y Lili Mip 2, respectivamente.

2.7. simulaciones de dinámica molecular

Desglicosilada nativo / ligando no unido, ácido-atados y estructuras Lili-MIP-ácido linoleico con destino fueron generados in silico oleico. simulaciones MD se realizaron utilizando GROMACS v.4.6.4 (Hess et al., 2008 [Hess, B., Kutzner, C., van der Spoel, D. & Lindahl, E. (2008). J. Chem. Teoría Comput . 4, 435-447.]) con el campo de fuerza GROMOS 43A1 (Schmid et al., 2012 [Schmid, N., Cristo, CD, Christen, M., Eichenberger, AP & Gunsteren, WF (2012). Comput Phys. Commun 183, 890-903];…. Gunsteren et al, 1996 [Gunsteren, W. van, Billeter, SR, Eising, AA, Hünenberger, P., Krüger, P., Marcos, A., scott, WRP y Tironi, I. (1996) Simulación Biomolecular:. El Manual de GROMOS96 y Guía del usuario de Zürich:.. Hochschulverlag AG an der ETH Zürich]) de 30 ns. Una caja cúbica se generó con una distancia mínima de 10 Å entre la proteína y el borde de la caja. Los modelos de proteínas se solvatados con el modelo de agua rígido SPC / E (Berendsen et al., 1987 [Berendsen, HJC, Grigera, JR y Straatsma, TP (1987). J. Phys. Chem. 91, 6.269 a 6.271.]) y se neutralizó con iones de sodio / cloruro, dependiendo de la carga neta de la proteína. minimización de energía fue llevada a cabo con el algoritmo más pronunciada en la ascendencia hasta que converge con un Fmax de no más de 1000 kJ mol-1 nm-1. la dinámica de posición con retención se llevaron a cabo durante 2,5 ps. Todos los bonos se vieron limitados utilizando el algoritmo lineal Solver de restricciones (LINCS). Las topologías de ácido oleico y ácido linoleico se generaron utilizando el servidor PRODRG (Schüttelkopf & van Aalten, 2004 [Schüttelkopf, A. W. & van Aalten, D. M. F. (2004). Acta Cryst. D60, 1355-1363.]). El sistema fue simulado en condiciones de contorno periódicas con puntos de corte de 10 Å para los términos de van der Waals. interacciones de largo alcance se calcularon utilizando el método de partículas de malla Ewald (PME). El análisis de componentes principales (PCA) también se llevó a cabo utilizando herramientas dentro del paquete GROMACS. Las parcelas de puercoespín se generaron utilizando la secuencia de comandos mode-vectores de PyMOL (Delano, 2002 [Delano, W. L. (2002). PyMOL. Http://www.pymol.org.]).

2.8. Los cálculos de los valores energéticos

El potencial energético de los cristales de Lili-MIP se dedujo mediante la aplicación de cálculos sencillos de proteína / azúcar / peso en lípidos (Tabla S4). Para comparar el potencial energético de cristales Lili-MIP con leches de mamíferos, los valores de peso se normalizaron a 100 g. Los valores energéticos para las diferentes leches se muestran en el cuadro complementario S3 (Gales del Norte Buffalo, 2009 [Gales del Norte Buffalo (2009). El análisis de la leche. Http://web.archive.org/web/20070929071651/http://www. northwalesbuffalo.co.uk/milk_analysis.htm. Obtenido 3 de agosto de 2009. (Cites McCane, Widdowson, Scherz, Kloos, Servicios internacionales de laboratorio.)]). Los valores del contenido de colesterol y calcio fueron omitidos para mantener la coherencia.

3. resultados

Cristales extraídos del intestino medio de D. embriones punctata (Fig. 1 [link]) se disolvieron y se sometió a electroforesis desnaturalizante de sodio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). El gel resultante reveló una racha, lo que sugiere que existe una heterogeneidad significativa (Complementario. Fig S1a). La separación de la muestra por electroforesis de flujo libre (FFE) a pH constante resuelve múltiples picos. láser de desorción / ionización asistida por matriz espectros de tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) de los dos cristales separados-FFE y disueltos (Complementario. Fig S2a) demostró heterogeneidad significativa de las muestras. Postulamos que esto se debe a la glicosilación heterogénea. Los espectros de masas de los cristales después del tratamiento manosidasa reveló que la glicosilación era-manosa enriquecido (Complementario. Fig S2b). El peso molecular más bajo fue de aproximadamente 18,8 kDa, mientras que el peso molecular más alto fue de aproximadamente 21,2 kDa, lo que sugiere que la glicosilación contribuye 10-12% de la masa.

 

3.1. Crystal heterogeneidad

El intestino medio de un solo embrión cucaracha contiene una gran cantidad de cristales Lili-MIP (complementario de la película S1). La heterogeneidad significativa entre los cristalina Lili-MIP se preveía debido a múltiples secuencias de aminoácidos primarias (Williford et al., 2004 [Williford, A., Stay, B. & Bhattacharya, D. (2004). Evol. Dev. 6, 67 -77.]), el potencial ramificado glicosilación y el contenido de ácidos grasos variable (Ingram et al., 1977 [Ingram, MJ, estancia, B. & Cain, GD (1977). Insect Biochem. 7, 257-267.]) . MALDI-TOF análisis por espectrometría de masas de solubilizado Lili-Mip de cristales purificados confirmó la composición molecular diversa, como se ilustra por un intervalo de pesos moleculares 22 a 30 kDa. Los desplazamientos de masa podrían revelar variaciones entre las moléculas dentro de un solo cristal, así como entre diferentes cristales. Liquid-cromatografía cuadrupolo tiempo de vuelo (LC-QTOF) análisis por espectrometría de masas de los péptidos generados por la tripsina o la digestión Asp-N de la glicosilada solubilizado y desglicosilado Lili-Mip confirmó la presencia de más de tres secuencias de polipéptidos diferentes en el cristales. Las secuencias de los tres polipéptidos (denotados Lili-MIP 1, 2 y 3), que comparten% de identidad de 80-90, podrían ser identificados. Una alineación destacando la similitud de secuencia de Lili-MIP 1, 2 y 3 se muestra en la figura complementaria. S1 (b). Además, los datos de espectrometría de masas indicaron más de una secuencia variante para algunos de los péptidos (Tabla 2 [link]). La secuencia con la mayor cobertura de análisis por espectrometría de masas se llama Lili-Mip 1. La secuencia completa de Lili-Mip 1 pueden ser considerados como la secuencia de consenso principal presente, junto con otros péptidos variantes en el cristal, con base en el ajuste a Los mapas de densidad electrónica (véase más adelante).

Tabla 2
Lili-MIP-péptidos secuencia de variantes observadas por análisis por espectrometría de masas

proteina leche cucaracha
El análisis de glicanos de solubilizada Lili-MIP mediante espectrometría de masas confirmó la presencia de cuatro sitios de glicosilación ligada a N, Asn35, Asn66, Asn79 y Asn145, con Lili-MIP 3 que contiene sólo tres sitios (el residuo 145 es Lys en Lili-MIP 3). La estructura de glicano de núcleo se compone de dos moléculas de N-acetilglucosamina (NAG) y una molécula de manosa (MAN). La presencia de paucimannose y manosa-enriquecido estructuras de glucanos con ramificaciones variables fueron confirmados para la proteína Lili-MIP. El análisis de masas sugiere además que el ligando unido en Lili-MIP podría ser ácido linoleico o ácido oleico. La extensión y el grado de heterogeneidad en la proteína Lili-MIP es revelado de los análisis de espectrometría de éstos.

3.2. determinación de la estructura de rayos X

La primera estructura cristalina por rayos X Lili-Mip se resolvió en 2,5 Å de resolución por la dispersión anómala de longitud de onda único método (SAD) utilizando la dispersión anómala de átomos de S en cisteínas y metioninas (Dauter y col., 1999 [Dauter, Z. , Dauter, M., de la Fortelle, E., Bricogne, G. & Sheldrick, GM (1999). J. Mol. Biol. 289, 83-92.]) de la proteína. La estructura de azufre SAD (S-SAD) se determinó a partir de datos recogidos de múltiples extraída cristales (película suplementario S1). Un conjunto completo de datos nativa se recogió de un solo cristal que difracta a 1,2 Å de resolución. Además, varios cristales se solubilizaron y se recristalizaron en vitro. Un tercer conjunto de datos se obtuvieron de un cristal de Lili-MIP-crecido vitro en. El modelo de partida para el refinamiento de estos dos conjuntos de datos fue la estructura refinada obtenida a partir de los datos de S-SAD. detalles cristalográficos se presentan en la Tabla 1 [link]. En todos los casos, Lili-Mip cristalizó en la red P1 triclínico, con una molécula por unidad asimétrica y los parámetros de la celda unidad a = 32,28, b = 33,22, c = 40,18 Å, α = 99,5, β = 100,28, γ = 104,11 ° .

La falta de redundancia de simetrías cristalográficos hace difícil para la eliminación gradual estructuras S-SAD de las proteínas que se cristalizan en el grupo espacial triclínico. Para el mejor de nuestro conocimiento, determinación de la estructura de cristales de P1 por este método no se ha informado anteriormente. La secuencia de la proteína Lili-Mip de 154 residuos de aminoácidos contiene cuatro cisteínas y una metionina. Con el fin de obtener la señal anómala más alta y relación de intensidad Bijvoet para eliminación fiable, se recogieron datos a una longitud de onda de 2,7 Å, que corresponde a una energía de rayos X de 4,59 keV. En esta energía, la señal anómala de átomos de S corresponde a? F ” = 1,51. La relación Bijvoet esperado para cuatro cisteínas libres y una metionina en 4,59 keV se calculó que era 1,62%, que es mayor que el límite Wang informado de 0,6% (Wang, 1985 [Wang, B.-C. (1985). Methods Enzymol . 115, 90-112.]). Los datos de alta redundancia se obtuvieron de 11 cristales isomorfos. La potencia de la eliminación gradual de cada conjunto de datos independientes era demasiado débil para la determinación de fase éxito. Como consecuencia, varias combinaciones de estos conjuntos de datos se iniciaron y se compararon en términos de la determinación de fase y la correlación anómala (valor de corte fijado en 30%). Siete conjuntos de datos se conservan, con un promedio de redundancia, Rsym y la media de E / σ (I) de 23,0, 38,1 y 0,067, respectivamente (Tabla 1 [link]). A partir de estos datos combinados, determinación de la estructura y la modificación automática de la densidad resultaron en mapas que podrían ser utilizados para construir la estructura inicial. La estructura refinada final tiene un total de 139 de 151 residuos de construcción, con valores Rwork y Rlibre de 15.5 y 23.3%, respectivamente. La gran diferencia es más probable debido a la fusión de siete conjuntos de datos diferentes para la eliminación gradual que se unen con una ligera no isomorfismo. Esto también se refleja en la diferencia en los parámetros de la celda unitaria de los datos procesados de forma independiente a partir de los cristales individuales. Si bien hay muy poca diferencia (± 0,1 Å) en las dimensiones A y C, hay una diferencia de ± 0,3 Å en la dirección b. Del mismo modo, la mayor variación en el ángulo está en el ángulo α (± 0,3 °). Este conjunto de datos combinados también se utilizó para el refinamiento de la estructura. La limitación de los datos a 2,5 Å de resolución es, sin embargo, no debido a esta falta de isomorfismo. Consideraciones prácticas experimentales para la recopilación de datos a 2,7 Å de longitud de onda y una distancia de cristal a detector de 60 mm restringidas recolección de datos a 2,5 Å de resolución.

3.3. Estructura de Lili-MIP

Una estructura de Lili-MIP de los cristales de la cucaracha del intestino medio revela un pliegue lipocalina (Fig. 2 [link] a). Los miembros de la familia de la lipocalina típicamente acomodar ligandos lipófilos en una cavidad en forma de un pliegue común compuesto de una β-barril central que comprende ocho cadenas antiparalelas con cuatro bucles peptídicos estructuralmente variables en la entrada abertura (Salier et al., 2004 [Salier, J. . -P, Åkerström, B., Borregaard, N. & Flor, DR (2004) Bioensayos, 26, 456-458];.. Skerra, 2000 [Skerra, A. (2000) Biochim Biophys Acta de 1482… , 337-350.]). El 2Fo – Fc y Fo – Fc mapas de densidad electrónica de la estructura de resolución 1,2 A reveló densidades para glicosilación en Asn35, Asn66, Asn79 y Asn145. En las posiciones 35 y 79, se identificaron una β-manosa (BMA) y dos NAGS. En Asn145 dos moléculas de NAG pueden ser modelados en la densidad, y uno NAG fue modelado en Asn66 (Fig. 2 [link] b). La NAG en Asn66 y los dos BMAS en Asn35 y Asn79 son parcialmente desordenada. Las moléculas de NAG están vinculados entre sí y a las moléculas de manosa a través de β (1 → 4) vínculos enlace glucosídico. Los datos cristalográficos estuvo de acuerdo con los datos de MS para la presencia de cuatro sitios de glicosilación ligada a N.

Figura 2

screenshot_6
estructura cristalina de Lili-MIP. (A) Diagrama de la historieta de la estructura Lili-MIP consiste en una α-hélice C-terminal (azul claro) y nueve beta-capítulos (magenta) que forman un cuerpo sin apretar para coordinar los lípidos. Los N-glicanos (amarillo) en los cuatro sitios de glicosilación se modelan en 2Fo – Fc densidad electrónica (blanco). (B) Vista de la superficie del Lili-MIP que muestra el 2Fo – mapa de densidad electrónica Fc (azul) contorneada a 1 x r.m.s. de los N-glicanos en Asn35, Asn79 y Asn145, y 0.5σ para que al Asn66. La malla de alambre (verde) en el centro de las estructuras en ambos paneles es el mapa de diferencia de densidad para la muestra de lípidos dibujado en 3.0σ.
Todos los modelos de mayor resolución posible de coordenadas diferentes lípidos dentro de un bolsillo hidrofóbico, ácido linoleico es decir, o ácido oleico (Fig. 3 [link] a). La cavidad en la estructura Lili-MIP es de 15 Å de profundidad, con un volumen de 727 A3, y tiene capacidad para ligandos cadena de ácidos grasos de 18 carbonos. Al lípidos libres de unión (Fig. 3 [link] b), aproximadamente 832 A2 del área superficial accesible al disolvente está enterrado en Lili-MIP, y sólo el grupo de cabeza polar y, posiblemente, un átomo de C adyacente se sientan fuera del bolsillo de unión. En las estructuras cristalinas, el grupo de cabeza del lípido y varios átomos de C más próximos al grupo de cabeza están desordenados. La distancia media aproximada entre los residuos que forman la Lili-MIP cavidad hidrofóbica y ácido linoleico o ácido oleico se resume en el cuadro complementario S2. 12 residuos (Val33, Ile36, Asp53, Glu61, His63, Phe76, Met78, Thr81, Glu83, Tyr84, Tyr88 y Phe100) forman una base para la interacción con los frentes de lípidos Lili-MIP. Cuatro residuos aromáticos (Phe76, Tyr84, Tyr88 y Phe100), en combinación con Leu113 y Glu38, delimitan la depresión más profunda, en particular mediante la formación de un establo π-apilamiento de los anillos Tyr88 y Phe100 que restringen la longitud del lípido.

figura 3

detalle proteina
la unión a Lili-MIP lípidos. (A) Primer plano de la superficie de contacto entre los lípidos (ácido linoleico, púrpura, ácido oleico, amarillo) y la cavidad hidrofóbica. Residuos que participan en la formación de la cavidad se modelan y se marcaron. El Fo – mapa de densidad electrónica Fc (dibujado en 3.0σ) de los lípidos en la cavidad de unión se muestra en verde. Como se menciona en el texto, los últimos átomos de carbono y el grupo cargado desordenada y son diferentes en las diferentes estructuras. El mapa de densidad electrónica es representado utilizando los datos de entrada PDB 4nyq. (B) la proyección de dos dimensiones de la coordinación de lípidos por residuos Lili-MIP:.. Diagrama LIGPLOT (Wallace et al, 1995 [Wallace, AC, Laskowski, RA & Thornton, JM (1995) Protein Eng 8, 127-134.. ]). Los átomos del lípido están etiquetados en los residuos negros y Lili-MIP se muestran en rojo. La dirección de las interacciones hidrófobas entre cada átomo del lípido y Lili-Mip está representado.

3.4. La heterogeneidad en la secuencia de aminoácidos Lili-MIP

A medida que avanzaba el refinamiento, pequeñas ambigüedades en las densidades de electrones de varias cadenas laterales (Fig. 4 [link]) sugirieron que los cristales contenían múltiples proteínas con diferentes secuencias de aminoácidos primarios, consistentes con las caracterizaciones previas de las proteínas de la leche (Williford et al. 2004 [Williford, A., Stay, B. & Bhattacharya, D. (2004). Evol. Dev. 6, 67-77.]). Considerando los factores B y trastorno alta entre cadenas laterales de aminoácidos, la heterogeneidad de seis de los 28 residuos puede ser visualizado claramente en la 2Fo – Fc y Fo – mapas de densidad electrónica Fc. En cada posición, después de modelar y refinar el residuo de una de las secuencias con ocupación parcial, se observó densidad adicional para el residuo correspondiente de otra secuencia. Higo. 4 [link] muestra los mapas de densidad electrónica para los residuos 12, 39 y 50. A pesar de varios intentos, la densidad diferencia no podría ser explicada por el modelado de conformaciones alternativas para estos residuos. La visualización de los mapas OMITIR obtenidos después de la eliminación de estos residuos reveló características que corresponden a la presencia de múltiples secuencias. Es raro que los cristales de proteínas heterogéneas difractan a resolución atómica, debido a su trastorno intrínseco. se observó Amino-ácido secuencia de heterogeneidad en las estructuras determinadas a partir de los tres conjuntos de datos. Dos de los conjuntos de datos fueron recogidos por completo de un solo cristal, mientras que un conjunto de datos (utilizado para S-SAD) se recogió a partir de múltiples cristales. Por lo tanto, se excluye la posibilidad de que esta heterogeneidad se derivaría únicamente debido a la fusión de los conjuntos de datos de múltiples cristales para la determinación de la estructura S-SAD. Podemos concluir de estas observaciones que el monómero obtenido en cada unidad asimétrica es un promedio de espacio de todas las secuencias, es decir, el cristal se hace de embalaje de proteínas con múltiples secuencias.
Figura 4

proteinas leche
2Fo – Fc (blanco) y Fo – Fc mapas (verde) de densidad electrónica de tres residuos donde la heterogeneidad se observa por cristalografía y espectrometría de masas. Todos los 2Fo – Fc mapas están contorneados a 1 x r.m.s. valores. (A) Residuo 12 es Pro en Lili-Mip 1 y Thr en Lili-Mip 2. El mapa de diferencias (verde) está en el nivel 3σ. (B) Residuo 39 es Val en Lili-MIP 1 y Phe en Lili-MIP 2. El mapa de diferencias (verde) está a nivel 2σ en el primer panel para mostrar el anillo completo de Phe. (C) Residuo 50 es Asn en Lili-MIP 1 y Thr en Lili-MIP 2. El mapa de diferencias (verde) se contornea en el nivel de 3σ. En las tres figuras, el panel 1 se muestran las densidades adicionales después de refinar sólo la secuencia Lili-MIP 1 (residuos en amarillo) y el panel 2 después de refinar sólo la secuencia Lili-MIP 2 (residuos en naranja). Panel 3 muestra que después de refinar tanto con Lili-Mip 1 y 2 secuencias, no se observan densidades adicionales. El mapa de densidad electrónica es representado utilizando los datos de entrada PDB 4nyq.

3.5. cristal de embalaje

Cada molécula de Lili-Mip está rodeado por seis moléculas en un plano y se encuentra entre otras dos moléculas (Fig 5 [link] a.): Uno arriba y otro abajo. Esto da la apariencia de las vainas de moléculas encerrados dentro de un cilindro formado por los seis moléculas en un plano (Fig. 5 [link] b). Hay tres regiones en la superficie de una molécula que interactúa fuertemente con las moléculas vecinas. El primer conjunto de interacciones consiste en un π-π apilamiento interacción entre el Tyr153 C-terminal de una molécula y Tyr142 de la molécula vecina. Curiosamente, Tyr153 de la primera molécula y Lys1 de la segunda molécula son proximal a la otra sin hacer ningún interacciones aparentes (Fig. 5 [link] c). En la segunda región, la hélice C-terminal (residuos 123-136) de una molécula se une a una ranura formada por un bucle (residuos 78-84), una beta-strand (residuos 59-65) y otro bucle (residuos 55 -58) en la molécula vecina. Lys131, presente en la hélice C-terminal, forma una interacción sal-puente con Glu61, que está enterrado en la ranura (Fig. 5 [link] d). La tercera área de interacción es mayor que las otras dos regiones. Aquí, Asn45 de una molécula forma un enlace de hidrógeno con Ser109 en la molécula vecina. Del mismo modo, Arg14 de la primera molécula de forma dos enlaces de hidrógeno a Gln32 en la molécula vecina (Fig. 5 [link] e). En conjunto, estas tres interacciones crean un retículo cristalográfica compacto de moléculas bien ordenadas. Curiosamente, los residuos heterogéneos son en su mayoría situados en la superficie pero no están involucrados en cristal de embalaje.
Figura 5

proteinas de cerca cucaracha
Crystal embalaje en Lili-MIP. (A) La disposición de las moléculas en un avión. Cada molécula está rodeado por otros seis moléculas. (B) de empaquetamiento cristalino general que muestra una funda dentro de una disposición de cilindro. (C) La interacción de apilamiento π-π entre Tyr153 y Tyr142 de dos moléculas vecinas. (D) La interacción hélice C-terminal con una ranura formada por los bucles y β-strand en la abertura del sitio de unión al ligando a través de un puente de sal entre Lys131 y Glu61. (E) La tercera región interacción entre las moléculas vecinas a través de enlaces de hidrógeno entre Asn45 y Ser109, así como Arg14 y Gln32.
3.6. La dinámica molecular estudios de simulación

la respiración molecular es un fenómeno en el que la garganta formada por los beta-capítulos sigue abierta a los lípidos de disolvente o listos para aceptar (complementario Fig. s3a) mientras no haya bucles específicos que se abren y cierran en la entrada. En las estructuras cristalinas unidos, la boca de la garganta muestra un diámetro de abertura de ~ 10 Å, lo que sugiere que los lípidos principalmente lineales cabrían dentro de la cavidad sin mayor remodelación de la conformación de la proteína. Para comprender el mecanismo de entrada de lípidos y la salida de la garganta, simulaciones de dinámica molecular se llevaron a cabo usando las proteínas generadas desglicosiladas silico-en. 30 ns simulaciones se realizaron con tres estructuras diferentes Lili-MIP de partida: nativo / ligando no unido (DglyNat), ácido oleico-bound (DglyOla) y ácido linoleico unido (DglyEic). Una comparación de la desviación de la raíz cuadrada media (r.m.s.d.) de las columnas vertebrales durante los tres 30 ns simulaciones (Complementario. Fig S3b) muestra que los sistemas de DglyNat, DglyOla y DglyEic estabilizan después de unos 15, 9 y 3 ns, respectivamente. Una comparación de los valores de la raíz cuadrada de la media de fluctuación (r.m.s.f.) para los átomos Cα de Lili-MIP en las tres simulaciones se muestra en la figura complementaria. S3 (c). Hay cuatro regiones designadas [I (residuos 30-35), II (residuos 50-65), III (residuos 75-85) y IV (residuos 102-112) en la figura complementaria. S3c] con mayor r.m.s.f. valores en comparación con otras regiones de la estructura. Curiosamente, estas cuatro regiones que rodean la apertura de la bolsa de unión de lípidos (Suplementario Fig. S3a). Para comprender la relativa apertura y cierre de los movimientos de estas cuatro regiones durante las tres simulaciones, análisis de componentes principales (PCA;.. Amadei et al, 1993 [Amadei, A., Linssen, AB y Berendsen, HJ (1993) Proteínas, 17, 412-425.]) se llevó a cabo y las parcelas de puercoespín de los vectores propios se generan a partir de las simulaciones (Fig. 6 [link]). En una parcela puercoespín, dos conformaciones extremas de una proteína están representados que muestran el máximo de movimiento en diferentes regiones durante una simulación. Como se destaca en la Fig. 6 [link], las cuatro regiones que rodean el bolsillo espectáculo desplazamiento máximo de unión a ligando / fluctuaciones en DglyNat en comparación con DglyOla o DglyEic. Tales fluctuaciones inherentes mayores en la estructura del ligando no unido sugieren un mecanismo plausible de la respiración molecular en Lili-MIP, donde los bucles de apertura y cierre hasta que se une un lípido. La unión del lípido estabiliza la forma cerrada.
Figura 6

Detalle proteinas de leche de cucarachas
parcelas de puercoespín que muestran los movimientos relativos de las cuatro regiones en los modelos desglicosiladas de (a) nativo, (b) el ácido oleico-atado y (c) el ácido linoleico unida a Lili-MIP. Las regiones I, II, III y IV son de color azul, rojo, verde y naranja, respectivamente.

4. Discusión

D. punctata ofrece uno de los pocos ejemplos de viviparidad entre los insectos. De manera similar a los mamíferos, la madre suministra la nutrición en la forma de una secreción de la leche, conocida como Lili-Mip, a las 9-12 embriones en desarrollo en su saco cría. Lili-Mip sirve como un nutriente completo, proporcionando todos los aminoácidos esenciales, los hidratos de carbono de los glicanos unidos, y lípidos a través de chaperones linoleico y oleico. Lili-Mips son la mayor fuente de nutrientes para el desarrollo de los embriones antes de su nacimiento. Después de la ingestión por los embriones, su concentración creciente en el intestino medio facilita la cristalización de Lili-MIP. La heterogeneidad significativa se observó en el contenido de la estructura primaria de proteínas, lípidos y la glicosilación de Lili-MIP; sin embargo, el papel preciso de la heterogeneidad optimizado para la cristalización en una sola celosía Actualmente no está claro.

Este es el primer informe de puesta en fase cristalográfica directa y determinación de la estructura de un cristal natural crecido in vivo en lugar de in vitro de las proteínas sobreexpresadas. La estructura de resolución atómica de crambina es un ejemplo de la determinación de la cristalización y la estructura de una proteína con micro-heterogeneidad en su secuencia primaria (Hendrickson y Teeter, 1981 [Hendrickson, WA y balanceo, MM (1981). Nature (London), 290 , 107-113];….. Teeter y Roe, 1993 [Teeter, MM & Roe, SM (1993) J. Mol Biol 230, 292-311]). Si bien hay ejemplos de una pequeña heterogeneidad en las estructuras cristalinas en la secuencia de proteínas, la glicosilación y la unión del ligando de manera independiente, a lo mejor de nuestro conocimiento, no existe una estructura cristalina reportado hasta la fecha que tiene la heterogeneidad en la secuencia de proteínas, carbohidratos y lípidos juntos. Desde luego, no es sorprendente que la mayoría de las estructuras con la heterogeneidad no difractan a alta resolución. Presentamos aquí un ejemplo único de cristales con una heterogeneidad significativa que difractan a resolución atómica. El grado de glicosilación asociada con cristales Lili-MIP es notable, como cristalización in vitro de proteínas glicosiladas es conocido por ser problemático.

Tras la determinación de la estructura, Lili-MIP se encontró que pertenecen a la familia de proteínas de lipocalina similar. La superposición de las estructuras Lili-MIP con diferentes modelos de lipocalinas resultó en r.m.s.d. valores que van desde 3,90 hasta 15,38 Å, lo que confirma la naturaleza muy redundante de este pliegue en forma de un calix (Tabla S1). Las diferencias principales entre estas proteínas residen en la conformación de la cavidad hidrofóbica utilizado para la coordinación de los lípidos, que determina el tipo de ligando que se puede acomodar, como conjuntos específicos de los lípidos, esteroides, bilins o retinoides (Flor et al., 1993 [ flor, DR, Norte, AC & Attwood, TK (1993). Protein Sci. 2, 753-761.]). Las estructuras sugieren que la energética de la cristalización (aunque cristalización de una mezcla heterogénea) crean un mecanismo de almacenamiento y la liberación que es simplemente dependiente de la concentración con el fin de suministrar nutrientes a medida que se necesitan.

Análisis de la composición de la leche secretada por las hembras embarazadas D. punctata indicó que los lípidos contribuyen 16-22% del peso en seco, con el colesterol de ser el único ácido linoleico esteroides y siendo el ácido graso más abundante (Ingram et al., 1977 [Ingram, MJ, Stay, B. & Caín, GD (1977). Insecto Biochem. 7, 257-267.]). El ácido linoleico es esencial para la dieta de la mayoría de los insectos, y en otros animales son conocidos lipocalinas para el transporte de moléculas hidrófobas, tales como colesterol y ácido linoleico, que no pueden ser sintetizados por los insectos de novo (Dadd, 1973 [Dadd, RH (1973). Annu Rev. Entomol 18, 381-420];….. Salier et al, 2004 [Salier, J.-P., Åkerström, B., Borregaard, N. & Flor, DR (2004) Bioensayos, 26, 456-458];. Skerra, 2000 [Skerra, A. (2000) Biochim Biophys Acta, 1482, 337-350];…. Flor et al, 1993 [Flor, DR, Norte, AC & Attwood, los conocimientos tradicionales. (1993). Protein Sci. 2, 753-761.]). El análisis de masas de los cristales de Lili-MIP muestra la presencia de ácidos linoleico y oleico. En la estructura cristalina, se observó una cadena de ácido graso larga en el barril que suponemos ser o el ácido linoleico o ácido oleico (Fig. 3 [link]). dinámica molecular estudios de simulación sugerido que se dirigía a ácido linoleico Lili-MIP tenía menos fluctuación de ácido oleico de ruedas o nativa Lili-MIP. Además, la unión de oleico frente a los resultados de ácido linoleico en los cambios conformacionales entre los residuos enterrados en el núcleo del pliegue lipocalina. Residuos Val51, Val65, Thr81, Ser86, Phe100 y Leu113 se alinean en la bolsa de unión y muestran múltiples conformaciones, lo que sugiere que tanto el ácido-atados y coexisten proteínas de ácido linoleico unida en el cristal oleico. Además, todos los residuos heterogéneos de la mezcla de proteínas se encuentran en la superficie de y no dentro del barril, lo que sugiere un bolsillo de unión conservadas.

La alta tasa de crecimiento de las larvas de D. punctata desde el nacimiento hasta la madurez reproductiva en 43-52 d (Willis et al., 1958 [Willis, ER, vertical, GR & Roth, LM (1958). Ann. Entomol. Soc. Am. 51, 53-69];. Stay & Coop de 1973 [eN CASA, B. & Coop, A. (1973) J. Physiol insectos 19, 147-171]), en comparación con los 160 d para la ovoviviparous maderae Rhyparobia… larvas, podría ser una consecuencia de la excepcional potencial energético de los cristales Lili-MIP. Entre el comienzo de la formación de yema de huevo en el ovario y el nacimiento de D. embriones punctata, el contenido de proteína aumenta 600 veces (Stay & Coop de 1973 [EN CASA, B. & Coop, A. (1973) Physiol insectos J… 19, 147-171]).; esto es aproximadamente nueve veces más de la proteína en larvas maderae R. (Dejmal y Brookes, 1968 [Dejmal, R. K. & Brookes, V. J. (1968). J. Physiol de insectos. 14, 371-381.]). El alto contenido de proteína es atribuible a la Lili-MIP proporcionada por el saco de cría y su almacenamiento en forma de cristales en el intestino medio del embrión. Un cristal intestino medio único de Lili-MIP representa aproximadamente el 3,7 × 10-5 J y corresponde a más de tres veces la energía proporcionada por las masas equivalentes de leches de mamíferos a partir de varias especies (Tabla S3). La formación de micelas de caseína es una característica funcional importante para el mantenimiento de la leche de mamífero con alto contenido de proteínas aún de baja viscosidad (Slattery y Evard, 1973 [Slattery, CW y Evard, R. (1973). Biochim. Biophys. Acta, 317, 529- 538.]). En contraste, el alto contenido de proteínas de la leche D. punctata se logra mediante cristalización de Lili-Mip en el intestino medio del embrión.

Hay numerosos ejemplos en la literatura, donde in vivo cristalización de proteínas está regulada por mecanismos tales como cambios iónicos, proteólisis y proteínas chaperonas (Doye y Poon, 2006 [Doye, JPK y Poon, WCK (2006). Curr. Opin. Coloide Interface Sci . 11, 40-46.]). La cristalización se induce mediante el aumento de la concentración de proteína a los niveles de sobresaturación que conduce a la nucleación, seguido por un conjunto ordenado. La recristalización in vitro de los solubilizados cristales Lili-MIP, utilizando únicamente la mayor polietilenglicol-peso molecular, demostró la alta propensión de esta proteína para la cristalización. Las fuertes interacciones observadas entre las moléculas relacionadas en la red podría ser una indicación de un fenómeno de nucleación eficiente. Análisis de la empaquetadura entre las proteínas en el cristal proporciona una posible explicación de la alta capacidad de cristalización de esta proteína. Presumiblemente, como los embriones comienzan a consumir la comida, la concentración de Lili-Mip en una disminución de la solución, causando que los cristales se disuelven. El equilibrio se mantiene, lo que permite la liberación de comida, ya que es una necesidad de nutrientes. En otras palabras, el almacenamiento de alimentos en forma cristalina no sólo permite una alta concentración de alimentos para ser almacenado, sino que también proporciona un mecanismo para la liberación controlada de nutrientes ya que se necesitan. La comprensión de la estructura molecular de estos en cristales de proteínas in vivo de cosecha nos permite apreciar cómo los principios de la termodinámica (cristal de embalaje) y la cinética (equilibrio entre cristalinas y solución Unidos) están exquisitamente utilizados en biología para proporcionar una ventaja evolutiva.

5. literatura relacionada

Las siguientes referencias se citan en la información de apoyo para este artículo: Robert & Gouet (2014 [Robert, X. y Gouet, P. (2014) Nucleic Acids Res 42, W320-W324…]) Y Sievers et al. (2011 [Sievers, F., Wilm, A., Dineen, D., Gibson, TJ, Karplus, K., Li, W., López, R., McWilliam, H., Remmert, M., Söding, J ., Thompson, JD y Higgins, DG (2011). Mol.. Syst Biol. 7, 539.]).